木瓜蛋白酶對(duì)兔膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎滑膜病變的誘導(dǎo)作用
張 林，張 兵，李 博，康 晉
西安醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院 骨外科，陜西 西安 710038

摘 要：目的 探討木瓜蛋白酶誘導(dǎo)兔膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎模型的滑膜病理變化。方法 納入 30 只新西蘭大白兔，隨機(jī)分為對(duì)照和模型組，模型組動(dòng)物均采用木瓜蛋白酶注射方式制備膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎模型，術(shù)后 2、4、6 周，分別取兩組各 5 只動(dòng)物，處死后獲得滑膜組織標(biāo)本，觀察一般情況，對(duì)兩組不同時(shí)間的滑膜進(jìn)行 Mankin 評(píng)分；蘇木精-伊紅（HE）染色觀察病理變化；酶聯(lián)免疫法檢測(cè)滑膜血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）和白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）表達(dá)水平。結(jié)果 木瓜蛋白酶單次注射后第 2 周，對(duì)模型組動(dòng)物進(jìn)行病理觀察，可見(jiàn)膝關(guān)節(jié)出現(xiàn)嚴(yán)重的滑膜炎性反應(yīng)，滑膜細(xì)胞與下層疏松纖維及血管組織均明顯增生，并存在大量淋巴漿細(xì)胞浸潤(rùn)；隨著時(shí)間推移，炎性反應(yīng)逐漸減輕。隨著注射時(shí)間的延長(zhǎng)，模型組 Mankin 評(píng)分、VEGF和 IL-1β 表達(dá)水平均呈下降趨勢(shì)，對(duì)照組無(wú)明顯變化；模型組木瓜蛋白酶注射后 2、4 周的 Mankin 評(píng)分、VEGF 和 IL-1β 表達(dá)水平均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），注射后 6 周的 Mankin 評(píng)分、VEGF 和 IL-1β 表達(dá)水平與對(duì)照組化比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論 木瓜蛋白酶可以誘導(dǎo)兔膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎模型，木瓜蛋白酶單次注射后第 2 周，兔膝關(guān)節(jié)滑膜炎性反應(yīng)嚴(yán)重，第4、6 周時(shí)炎性反應(yīng)逐漸減輕。
關(guān)鍵詞：膝關(guān)節(jié)；骨關(guān)節(jié)炎；木瓜蛋白酶；動(dòng)物模型；滑膜；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）；白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）

中圖分類(lèi)號(hào)：R965.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1674 - 6376(2018)01 - 0078 - 05
DOI: 10.7501/j.issn.1674-6376.2018.01.013
骨關(guān)節(jié)炎是一種慢性關(guān)節(jié)疾病，以關(guān)節(jié)軟骨退行性變以及繼發(fā)性骨質(zhì)增生為主要特征[1]。以往對(duì)骨關(guān)節(jié)炎的研究大多集中在關(guān)節(jié)軟骨以及軟骨細(xì)胞和軟骨下骨等方面[2-4]，但越來(lái)越多的資料表明，關(guān)節(jié)周?chē)幕づc疾病之間存在十分密切的關(guān)系。木瓜蛋白酶注射方式誘導(dǎo)膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎是常用的模型制備方法，具有操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)[5]，但關(guān)于其誘導(dǎo)膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎模型對(duì)滑膜病理作用的相關(guān)問(wèn)題，報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)利用新西蘭大白兔，采用木瓜蛋白酶注射方式制備膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎模型，通過(guò)對(duì)注射后不同時(shí)間動(dòng)物滑膜進(jìn)行 Mankin 評(píng)分和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）和白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）表達(dá)水平檢測(cè)，探討木瓜蛋白酶誘導(dǎo)膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎模型兔滑膜病的作用機(jī)制。
1 材料
1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
30 只新西蘭大白兔，雌性，體質(zhì)量約 2 kg，健康狀況良好，均由山東省農(nóng)科院提供，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（魯）2010-0025。本次研究相關(guān)方案均提交本院醫(yī)學(xué)倫理部門(mén)審核，并經(jīng)批準(zhǔn)，符合相關(guān)倫理學(xué)要求。
1.2 藥物及主要試劑
木瓜蛋白酶，批號(hào) Z26149871，規(guī)格 500 mL，上海子起生物科技有限公司；乙醇，北京綠源大德生物科技有限公司；磷酸緩沖（PBS）液，上海心語(yǔ)生物科技有限公司；VEGF 酶聯(lián)免疫試劑盒，上海恒遠(yuǎn)生化科技有限公司；IL-1β 酶聯(lián)免疫試劑盒，北京綠源大德生物科技有限公司；中性甲醛，上海瑤韻生物科技有限公司；鹽酸乙醇，上海研盟生命科學(xué)發(fā)展有限公司；勻漿器，北京明陽(yáng)科華生物科技有限公司；光學(xué)顯微鏡，北京五洲東方科技發(fā)展有限公司。
2 方法
2.1 動(dòng)物分組及膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎模型[6-8]的制備30 只動(dòng)物隨機(jī)分為 2 組：對(duì)照組、模型組，每組 15 只。模型組動(dòng)物均采用木瓜蛋白酶注射制備膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎模型，選擇兔左膝關(guān)節(jié)進(jìn)行常規(guī)備皮和乙醇消毒，屈曲 45°，利用注射器進(jìn)行 4%木瓜蛋白酶水溶液注射。進(jìn)針點(diǎn)為髕骨下極髕腱外緣，注射中向髁間窩方向進(jìn)針，達(dá)到股骨髁后回撤 2 mm，注射溶液 0.1 mL。術(shù)后觀察動(dòng)物注射側(cè)情況，如果出現(xiàn)明顯的腫脹，存在屈伸功能障礙，則視為建模成功。經(jīng)觀察，本次模型組 15 只動(dòng)物均建模成功。對(duì)照組不予以特殊處理，術(shù)后對(duì)兩組動(dòng)物置于相同的環(huán)境下喂養(yǎng)。
2.2 術(shù)后標(biāo)本獲取[9]
木瓜蛋白酶注射后第 2、4、6 周，各組分別取5 只動(dòng)物，麻醉后處死。即刻切取髕下脂肪墊處滑膜組織約 0.3 mm。利用 PBS 液對(duì)組織標(biāo)本進(jìn)行洗滌，平均分為兩份，一份用于滑膜組織病理觀察與Mankin 評(píng)分，另一份用于酶聯(lián)免疫法檢測(cè) VEGF和 IL-1β 水平。
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