GIBCO血清培養乳鼠心肌細胞操作說明

                      GIBCO血清培養乳鼠心肌細胞操作說明

材料：乳鼠（1-3d）
試劑：DMEM/F12（gibco），FBS（四季青），0.125%混合酶（胰酶和膠原酶1），GIBCO血清
器材：高壓包1（眼科剪、鑷2套，200目濾網1個），高壓包2（消化用小錐形瓶及轉子和蓋子，9cm平皿1套，100ml燒杯2個），高壓包3（小紗布塊，細胞計數板），離心管（nunc，15ml，無菌），吸管（一次性單包裝無菌，碧云天），酒精棉球，75%酒精1瓶，口罩，帽子，手套，mark筆，離心機，超凈臺，培養箱，磁力攪拌器（可控溫），水浴鍋，消化水浴杯（內有300ml雙蒸水），臥式染色缸1套（取心用），自制小支架2個（墊平皿用）。
（值得注意的是我所用的裝培養基的瓶子都是藍色絲口瓶，這種瓶子瓶口大，相對來說不容易污染。）
步驟：
一、準備
1.  帶口罩、帽子，洗手，入培養室
2.  酒精棉球擦拭超凈臺后，放高壓包123和離心管、吸管、酒精棉球缸于超凈臺內；
3.  放75%酒精1臥式染色缸一套（打開蓋）、mark筆于超凈臺外，放消化水浴杯于磁力攪拌器上（開機，溫度37度，轉速小于100）在超凈臺外；
4.  放15%*培養基和消化酶于水浴鍋內（開機，溫度37度）
5.  開超凈臺和培養室紫外30min。
二、30min后
1.帶手套，洗凈滑石粉，烘干后入培養室，關紫外，開超凈臺風機，酒精擦手。
2.取4度不*培養基置于超凈臺上，取平皿分為兩個，每個里面各放一套器械，然后各加不*培養基8ml，取100ml燒杯一個。將100ml燒杯和其中一個平皿放在超凈臺外的桌子上，100ml燒杯中倒入75%酒精。
3.拿鑷子夾乳鼠，在燒杯中浸泡5-10秒，然后置于殺鼠臺上（就是臥式染色缸的蓋子），剪刀撕開皮膚，開胸（注意不要損傷消化道），除心包，擠壓后取心，直接取心室肌，置于裝有4度不*培養基的平皿中。以此類推，直至全部取完。
4.只將有心肌的平皿放回超凈臺，酒精擦手。
5.用第2套剪刀先略微剪一下，基本上把每個心臟剪成兩半，目的在于先跑跑血。然后，小心移入另一個平皿，簡單沖洗后，留下少許液體，猛剪，直到您滿意為止。然后再用不*培養基洗三遍。用吸管移植消化用錐形瓶。
6.加入消化酶10ml，水浴杯內消化10-15min，*次棄上清；剩余組織中再次加入混合酶繼續磁力消化，靜置后將上清液移入含15%FBS的DMEM/F12培養基的離心管終止消化，4℃保存；剩余組織用同樣方法反復消化，直至消化*。1 200 r/min離心10 min，棄上清，用培養液制成單細胞懸液，接種于25 cm培養瓶
7. 37度、5% CO2培養箱中孵育1.5 h，吸出細胞懸液離心，細胞計數板計數，調整細胞濃度為1-5×106個/ml后接種于培養瓶和鋪有爬片的6孔板。
8. 24h后觀察，期間不要看細胞。24h即可見同步搏動了。
三、收拾培養室，寫實驗記錄。 

我司代理的胎牛血清品牌有NQBB、Gibco、invitrogen、BD等，血清主要產自于澳大利亞，血源以封閉的心臟穿刺方式采自8月齡胎牛，產品經3次100nm過濾，在凈化車間過濾包裝。經嚴格檢測確保無支原體，細菌病毒檢測依據美國藥典（USP）和美國聯邦法規第九篇（9CFR），符合檢測標準。