細(xì)胞凋亡是一種細(xì)胞主動(dòng)有序的死亡，它涉及一系列基因的激活、表達(dá)以及調(diào)控等作用，它并不是病理?xiàng)l件下自體損傷的一種現(xiàn)象，而是為了更好地適應(yīng)生存環(huán)境而主動(dòng)爭(zhēng)取的一種死亡。本期恒遠(yuǎn)生物給大家介紹細(xì)胞凋亡檢測(cè)實(shí)驗(yàn)的方法，一起來(lái)學(xué)習(xí)下吧！
一、PI 單染色法
1. 收集細(xì)胞｛數(shù)目約（1~ 5）×106 個(gè)/mL｝，500 ~ 1000 r/min 離心 5min，棄去培養(yǎng)液。
2. 3ml PBS 洗滌 1 次。
3. 離心去 PBS，加入冰預(yù)冷的 70%的乙醇固定，4℃，1—2 小時(shí)。
4. 離心棄去固定液，3mlPBS 重懸 5min。
5. 400 目的篩網(wǎng)過(guò)濾 1 次，500—1000r/min 離心 5min，棄去 PBS。
6. 用 1ml PI 染液染色，4℃避光 30min。
7. 流式細(xì)胞儀檢測(cè)：PI 用氬離子激發(fā)熒光，激光光波波長(zhǎng)為 488nm，發(fā)射光波波長(zhǎng)大于630nm，產(chǎn)生紅色熒光分析 PI 熒光強(qiáng)度的直方圖也可分析前散射光對(duì)側(cè)散射光的散點(diǎn)圖。
8. 結(jié)果判斷：在前散射光對(duì)側(cè)散射光的散點(diǎn)圖或地形圖上，凋亡細(xì)胞與正常細(xì)胞相比，前散射光降低，而側(cè)散射光可高可低，與細(xì)胞的類(lèi)型有關(guān)；在分析 PI 熒光的直方圖時(shí)，先用門(mén)技術(shù)排除成雙或聚集的細(xì)胞以及發(fā)微弱熒光的細(xì)胞碎片，在 PI 熒光的直方圖上，凋亡細(xì)胞在G1/G0 期前出現(xiàn)一亞二倍體峰。如以 G1/G0 期所在位置的熒光強(qiáng)度為 1.0，則一個(gè)典型的凋亡細(xì)胞樣本其亞二倍體峰的熒光強(qiáng)度為 0.45，可用雞和鮭魚(yú)的紅細(xì)胞的 PI 熒光強(qiáng)度做參照標(biāo)準(zhǔn)，兩者分別為 0.35 和 0.7，可以確保在兩者之間的不是細(xì)胞碎片而是完整的細(xì)胞。
注意事項(xiàng)：
細(xì)胞凋亡時(shí)，其 DNA 可染性降低被認(rèn)為是凋亡細(xì)胞的標(biāo)志之一，但這種 DNA 可染性降低也可能是因?yàn)?DNA 含量的降低，或者是因?yàn)?DNA 結(jié)構(gòu)的改變使其與染料結(jié)合的能力發(fā)生改變所致。在分析結(jié)果時(shí)應(yīng)該注意。
二、Annexin V/PI 雙染色法
1. 細(xì)胞收集：懸浮細(xì)胞直接收集到 10ml 的離心管中，每樣本細(xì)胞數(shù)為（1~5）×106，/mL 500~1000r/min 離心 5min，棄去培養(yǎng)液。
2. 用孵育緩沖液洗滌 1 次，500~1000r/min 離心 5min。
3. 用 100ul 的標(biāo)記溶液重懸細(xì)胞，室溫下避光孵育 10~15min。
4. 500~1000r/min 離心 5min 沉淀細(xì)胞孵育緩沖液洗 1 次。
5. 加入熒光（SA-FLOUS）溶液 4℃下孵育 20min，避光并不時(shí)振動(dòng)。
6. 流式細(xì)胞儀分析：流式細(xì)胞儀激發(fā)光波長(zhǎng)用 488nm，用一波長(zhǎng)為 515nm 的通帶濾器檢測(cè) FITC 熒光，另一波長(zhǎng)大于 560nm 的濾器檢測(cè) PI。
7. 結(jié)果判斷：凋亡細(xì)胞對(duì)所有用于細(xì)胞活性鑒定的染料如 PI 有抗染性，壞死細(xì)胞則不能。
總結(jié)：細(xì)胞膜有損傷的細(xì)胞的 DNA 可被 PI 著染產(chǎn)生紅色熒光，而細(xì)胞膜保持完好的細(xì)胞則不會(huì)有紅色熒光產(chǎn)生。因此，在細(xì)胞凋亡的早期 PI 不會(huì)著染而沒(méi)有紅色熒光信號(hào)。正常活細(xì)胞與此相似。在雙變量流式細(xì)胞儀的散點(diǎn)圖上，左下象限顯示活細(xì)胞，為（FITC-/PI-）；右上象限是非活細(xì)胞，即壞死細(xì)胞，為（FITC+/PI+）；而右下象限為凋亡細(xì)胞，顯現(xiàn)（FITC+/PI- ）
三、Heochst 33342/PI 雙染色法
1. 懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞在培養(yǎng)的狀態(tài)下加入 Heochst 33342 ，終濃度為 1ug/ml； 37℃孵育7—10min。
2. 低溫 500 ~ 1000r/min 離心 5min 棄去染液。
3. 加入 1.0ml PI 染液，4℃避光染色 15min。
4. 400 目的篩網(wǎng)過(guò)濾 1 次。
5. 流式細(xì)胞儀分析：Heochst 33342 用氪激光激發(fā)的紫外線(xiàn)熒光，激發(fā)光波波長(zhǎng)為352nm，發(fā)射光波波長(zhǎng)為 400 ~ 500nm，產(chǎn)生蘭色熒光；PI 用氬離子激光激發(fā)熒光，激發(fā)光波波長(zhǎng)為 488nm，發(fā)射光波波長(zhǎng)大于 630nm，產(chǎn)生紅色熒光。分析蘭色熒光對(duì)紅色熒光的散點(diǎn)圖或地形圖。
6. 結(jié)果判斷：在蘭色熒光對(duì)紅色熒光的散點(diǎn)圖上，結(jié)果為：正常細(xì)胞為低藍(lán)光/低紅光，凋亡細(xì)胞為高藍(lán)光/低紅光，壞死細(xì)胞為低藍(lán)光/高紅光。
注意事項(xiàng)：
① 在紅色熒光對(duì)蘭色熒光散點(diǎn)圖上，還可見(jiàn)到細(xì)胞凋亡區(qū)向細(xì)胞壞死區(qū)遷移的軌跡，可能是凋亡細(xì)胞的 DNA 進(jìn)一步降解的緣故。
② 用 Heochst 33342 染料與細(xì)胞孵育的時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，一般控制在 20min 之內(nèi)為宜。如果太長(zhǎng)可引起 Heochst 33342 的發(fā)射光譜由藍(lán)光向紅光的遷移，導(dǎo)致紅色熒光與蘭色熒光的比例改變，從而影響結(jié)果的判斷。
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