恒遠(yuǎn)生物|免疫熒光技術(shù)的基本原理

免疫熒光技術(shù)又稱(chēng)熒光抗體技術(shù)，是標(biāo)記免疫技術(shù)中發(fā)展zui早的一種。它是在免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來(lái)的一項(xiàng)技術(shù)。很早以來(lái)就有一些學(xué)者試圖將抗體分子與一些示蹤物質(zhì)結(jié)合，利用抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行組織或細(xì)胞內(nèi)抗原物質(zhì)的定位。





該技術(shù)的主要特點(diǎn)是：特異性強(qiáng)、敏感性高、速度快。

主要缺點(diǎn)是：非特異性染色問(wèn)題尚未完quan解決，結(jié)果判定的客觀(guān)性不足，技術(shù)程序也還比較復(fù)雜。




一、原理




免疫學(xué)的基本反應(yīng)是抗原-抗體反應(yīng)。由于抗原抗體反應(yīng)具有高度的特異性，所以當(dāng)抗原抗體發(fā)生反應(yīng)時(shí)，只要知道其中的一個(gè)因素，就可以查出另一個(gè)因素。免疫熒光技術(shù)就是將不影響抗原抗體活性的熒光色素標(biāo)記在抗體（或抗原）上，與其相應(yīng)的抗原（或抗體）結(jié)合后，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)一種特異性熒光反應(yīng)。




直接法：將標(biāo)記的特異性熒光抗體，直接加在抗原標(biāo)本上，經(jīng)一定的溫度和時(shí)間的染色，用水洗去未參加反應(yīng)的多余熒光抗體，室溫下干燥后封片、鏡檢。




間接法：如檢查未知抗原，先用已知未標(biāo)記的特異抗體（第一抗體）與抗原標(biāo)本進(jìn)行反應(yīng)，用水洗去未反應(yīng)的抗體，再用標(biāo)記的抗抗體（第二抗體）與抗原標(biāo)本反應(yīng)，使之形成抗原—抗體—抗體復(fù)合物，再用水洗去未反應(yīng)的標(biāo)記抗體，干燥、封片后鏡檢。如果檢查未知抗體，則表明抗原標(biāo)本是已知的，待檢血清為第一抗體，其它步驟的抗原檢查相同。標(biāo)記的抗抗體是抗球蛋白抗體，同于血清球蛋白有種的特異性，如免疫抗雞血清球蛋白只對(duì)雞的球蛋白發(fā)生反應(yīng)，因此，制備標(biāo)記抗體適用于雞任何抗原的診斷。




二、技術(shù)分類(lèi)：




1.熒光抗體技術(shù)（熒光顯微鏡技術(shù)）




抗原抗體反應(yīng)后，利用熒光顯微鏡判定結(jié)果的檢測(cè)方法。




2.免疫熒光測(cè)定技術(shù)：




抗原抗體反應(yīng)后，利用特殊儀器測(cè)定熒光強(qiáng)度而推算被測(cè)物濃度的檢測(cè)方法。




1）熒光物質(zhì)




熒光色素




許多物質(zhì)都可產(chǎn)生熒光現(xiàn)象，但并非都可用作熒光色素。只有那些能產(chǎn)生明顯的熒光并能作為染料使用的有機(jī)化合物才能稱(chēng)為免疫熒光色素或熒光染料。




常用的熒光色素：




（1）異硫氰酸熒光素為黃色或橙黃色結(jié)晶粉末，易溶于水或酒精等溶劑。分子量為389.4，zui大吸收光波長(zhǎng)為490495nm，zui大發(fā)射光波長(zhǎng)520530nm，呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光有兩種同分異結(jié)構(gòu)，其中異構(gòu)體Ⅰ型在效率、穩(wěn)定性、與蛋白質(zhì)結(jié)合能力等方面都geng好，在冷暗干燥處可保存多年，是應(yīng)用zui廣泛的熒光素。




其主要優(yōu)點(diǎn)是：




①人眼對(duì)黃綠色較為敏感




②通常切片標(biāo)本中的綠色熒光少于紅色。




（2）四乙基羅丹明為橘紅色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙-酮。性質(zhì)穩(wěn)定，可長(zhǎng)期保存。zui大吸收光波長(zhǎng)為570nm，zui大發(fā)射光波長(zhǎng)為595-600nm，呈橘紅色熒光。




（3）四甲基異硫氰酸羅丹明，zui大吸引光波長(zhǎng)為550nm，zui大發(fā)射光波長(zhǎng)為620nm，呈橙紅色熒光。與FITC的翠綠色熒光對(duì)比鮮明，可配合用于雙重標(biāo)記或?qū)Ρ热旧Ｆ洚惲蚯杌膳c蛋白質(zhì)結(jié)合，但熒光效率較低。




常見(jiàn)熒光素的特性：




1）FITC：黃色結(jié)晶粉末，吸收光：490～495nm，發(fā)射光：520～530nm，明亮的黃綠色熒光。




2）RB200： 橘紅色粉末, 吸收光570nm，發(fā)射光 595～600nm，橘紅色熒光。




3）TRITC： 紫紅色粉末，吸收550nm，發(fā)射光 620nm，橙紅色熒光。




4）鑭系：Eu3+、Tb3+




5）PE：吸收光490～560nm，發(fā)射光 595nm，紅色熒光。




6）其它：酶作用后產(chǎn)生熒光物質(zhì)。